淺析質(zhì)粒與載體

 

一、質(zhì)粒的組成要素


a復(fù)制起始位點(diǎn)Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。
b 抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+
c 多克隆位點(diǎn)MCS 克隆攜帶外源基因段
d P/E 啟動子/增強(qiáng)子
e Terms 終止信號
f 加poly（A）信號 可以起到穩(wěn)定mRNA作用


二、質(zhì)粒圖譜如何讀取


*步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。
（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418（長那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA段。一般來說，外源DNA段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
啟動子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號
a 啟動子－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。
b增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。
c核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體
d 轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的zui后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的zui后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。
 


三、載體相關(guān)知識


1. 載體的概念
    載體主要有病毒和非病毒兩大類,即要把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。
P.S.基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA


2. 載體的分類
按功能分成：

（1）克隆載體都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來克隆和擴(kuò)增DNA段（基因）的載體。（所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）
（2）表達(dá)載體 具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。


按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：

（1）原核載體 

（2）真核載體 

（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.

3. 基因工程載體的特點(diǎn)：
（一）都能獨(dú)立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA段，能被動的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。
（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。
（三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。


4. 載體的選擇和制備：
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。
載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：
【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
【2】.載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質(zhì)粒。
（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
（3）對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點(diǎn)：
①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；
②用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯位；
③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。
選用質(zhì)粒（zui常用）做載體的4點(diǎn)要求：
①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；
②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。
③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；
④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。